天津津騰實驗設備有限公司
1 引 言
如同在地球上一樣，微生物在飛船上是廣泛存在的。俄羅斯載人航天的經驗證明隨著飛行時間的延長，飛船中微生物的危害會越來越嚴重 [1-3] 。在太空中微生物的危害對人體而言主要是影響乘組健康，作為病原體引起感染、過敏 [4] ；同時微生物能釋放有害氣體，成為間接的致病源；對飛船系統而言，一些生物降解類微生物能夠降解飛船材料、腐蝕儀器儀表，影響飛船硬件設備穩定性致使儀器及系統失靈等 [5] 。因此微生物快速鑒定技術對于評估飛船環境意義重大。
目前，國際空間站主要使用傳統培養法在軌進行菌落計數，而更細致的分類鑒定受到座艙條件的限制只能在地面進行。多年來 NASA 一直在尋求在軌免培養微生物快速鑒定方法 [6] 。一方面免培養法較培養法能快速、準確、靈敏地反映環境中微生物的多樣性，在微生物檢測和多樣性研究研究中得到了廣泛的應用 [7] ；另一方面，培養法可能會低估微生物種群的數量，因為某些微生物具有非培養存活能力，或需要特殊培養條件 [8，9] 。盡管如此，免培養法在空氣微生物多樣性研究領域尚未得到廣泛應用，其主要原因在于沒有有效的適于免培養應用的空氣微生物采樣及元基因組 DNA 提取方法。
本文優化了微孔濾膜采集空氣微生物條件，建立了元基因組 DNA 快速提取方法，并通過革蘭氏陰性菌-大腸桿菌和革蘭氏陽性菌-金黃色葡萄球菌驗證，所得 DNA 滿足 PCR 擴增需要，為空氣微生物免培養快速鑒定奠定了基礎。
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 菌種
大腸桿菌（Escherichia coli ）和金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus），兩者均為實驗室保藏菌種。
2.1.2 儀器
生物安全柜（BHC-1300IIA2）、臺式高速冷凍離心機（CT14RD）、循環水多用真空泵（SHB-3，10L/min）、溫度梯度 PCR 儀、智能蒸汽滅菌器（VPL-A5032）、過濾式空氣采樣器、微孔濾膜（0.22μm 和0.45μm）。
2.1.3 試劑
TE（100mmol/L Tris.Cl，10mmol/L EDTA，pH8.0）、試劑盒 1：土壤基因組 DNA 快速提取試劑盒（離心柱型）、試劑盒 2：超純土壤基因組 DNA 提取試劑盒、試劑盒 3：細菌、真菌 DNA 快速提取試劑盒、DNA 快速提取液 （1% Triton X-100，0.5% Tween 20，10mMTris·Cl （pH 8.0））、PCR 擴增體系（2.5U/μL Taq DNAPolymerase、10×Taq Buffer、2.5mmol/L dNTPs、去離子
雙蒸水、20μmol/L 引物）、溶葡萄球菌酶。
2.2 方法
2.2.1 空氣樣品元基因組 DNA 提取方法
（1）樣品制備
采用摻菌法，以確保樣品中含有一定數量的微生物。具體方法如下：抽濾 250L 空氣，將先其中的懸浮物采集在 0.22μm 微孔濾膜上，用 1mL TE 緩沖液洗脫濾膜上采集的樣品，121℃滅菌 30min 后加入1.3×10 7 cfu 的大腸桿菌和 2.7×10 7 cfu 的金黃色葡萄球菌，10000rpm 離心 5min，棄上清，沉淀用于 DNA提取。
（2）元基因組 DNA 提取
采用試劑盒 1、試劑盒 2、試劑盒 3（提取方法參說明書）和 DNA 快速提取液進行 DNA 提取。DNA快速提取液提取方法為：在樣品中加入 300μL 的提取液，100℃煮沸 5min，10000rpm 離心 5min，得上清為元基因組 DNA，用 0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
（3）元基因組 DNA 檢驗
得到的元基因組 DNA 采用紫外分光光度計測定 OD 260nm ，計算得 DNA 得率，并分別用大腸桿菌特異 引 物 （Alr1:5’-CTGGAAGAGGCTAGCCTGGAC－GAG-3’和 Alr2 :5’-AAAATCGGCACC GGTGGAGC－GATC-3’）[10]和金黃色萄球菌特異引物（nucF:
5' -GCGATTGAT GGTGATACGGTI-3' 和 nucR:5'-AGCCAAGCCTT GACGAACTAAAGC -3'） [11] 進 行PCR 擴增，進一步比較不同實驗方法提取 DNA 的效果。
2.2.2 空氣樣品采集方法
將過濾式空氣采樣器通過真空膠管鏈接于SHB-3 循環水多用真空抽氣泵（抽氣量 10L/min），根據濾膜孔徑和抽濾時間設計如下采集方案（表 1）：樣品采集結束后，用 TE 緩沖液將采集物從微孔濾膜上洗脫下來，然后用 1.2.1.2 確定的方法提取元基因組 DNA，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并采用細菌16S rDNA 通用引物 27F（5’- AGAGTTTGATCMTG－GCTCAG-3’）和 1525R（5’-AGAAAGGAGGTGWTC－CARCC -3’）[12] 進行 PCR 擴增，檢驗提取 DNA 的質量。25μl 擴增體系中加 1μl DNA 模板，2U Taq DNA聚合酶，其它為常規用量。擴增程序為：95℃預變性4min，95℃變性 45s，55℃退火 90s，72℃延伸 1min，72℃后延伸 5min，30 循環。擴增結束后，0.7%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。
3 結 果
3.1 樣品 DNA 提取方法的確定
根據 OD 260nm 測定結果計算得到的采用摻菌法各方法提取 DNA 的得率見表 2，結果表明：試劑盒 1DNA 提取得率最高，且重現性好，試劑盒 2 和快速DNA 提取液 DNA 得率明顯低于試劑盒 1，而試劑盒3 DNA 得率最低。根據元基因組 DNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果（圖 1）：各方法提取得到的 DNA 分子量都在 20kb 以上，調帶較為整齊。采用所提的元基因組 DNA 進行大腸桿菌和金黃色葡萄球菌特異引物擴增的結果如圖 2 所示。
總體來看，除試劑盒 3 外，其它三種方法得到的 DNA 都得到了大腸桿菌的特異擴增產物片段（約 370bp），且試劑盒 1 提取得到的 DNA 的擴增效果最好；雖然試劑盒 1、試劑盒 2 提取的 DNA 樣品得到了金黃色葡萄球菌特異擴增片段（約 290bp），但是擴增效果較差。說明即使是試劑盒 1，對金黃色葡萄球菌 DNA 的提取效果也較差。因此，以效果最好的試劑盒 1 提取法為基礎，對實驗方法進行了如下改進：（1）在第 2 步 37℃水浴時加入 12U 的溶葡萄球
菌酶，并將水浴時間和第 3 步 65℃水浴時間延長到30min～60min。
（2）將使用說明中第 9 步改為：加入二倍體積的冰乙醇，充分混勻，10000rpm 離心 10min，小心倒掉上層懸液；加入適量體積的 70%乙醇，輕輕彈離心管的底部使 DNA 懸浮后，10000rpm 離心 10min，棄乙醇，晾干；最后用 30μl 洗脫緩沖液 EB 溶解沉淀即可。
實驗方法改進前后 DNA 特異引物擴增結果比較見圖 3，顯然改進提取方法后大腸桿菌和金黃色葡萄球菌特異擴增效率均有所提高，尤其是金黃色葡萄球菌的擴增效率改善明顯。
3.2 不同采樣方法效果的比較
上述結果說明改進的提取方法對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌都適用，因此以改進的試劑盒 1 提取方法為標準，評價不同采樣方法所得樣品是否滿足元基因組 DNA 提取及 PCR 擴增要求。檢測結果如圖 4 所示：結果顯示：用兩種孔徑的微孔濾膜采集 30min所得樣品均不能提取得到滿足普通 PCR 檢測所需的 DNA；而用兩種孔徑的微孔濾膜采集 45min 和60min 所得樣品均可提取得到滿足普通 PCR 要求的DNA，但總體上 0.22μm 微孔濾膜采集所得樣品提取DNA 后擴增效果要比 0.45μm 微孔濾膜好，并且采集時間在 60min 時所得 DNA 擴增效率最高。說明采集 30min 時所得樣品中微生物數量太少，尚不足以提取得到滿足普通 PCR 檢測的 DNA，采集 45min 時所得樣品中微生物數量雖已可提取得到滿足普通PCR 檢測靈敏度要求量的 DNA。但若適當延長采樣時間，增加采集的空氣體積，則對于分析空氣中低豐度的微生物更合適些。
4 討 論
目前空氣微生物樣品采集多采用撞擊法或自然沉降法，這兩種方法均以培養為基礎檢測微生物 [13] 。在飛船上，環境微生物檢測需快速、敏感，而傳統的培養法無法滿足此要求。免培養法能達到快速、高效、準確檢測微生物的目的，已成為研究各類環境微生物多樣性的重要方法，但是在空氣微生物多樣性研究領域尚未得到廣泛應用，其主要原因在于沒有有效的適于免培養應用的空氣微生物采樣及元基因組 DNA 提取方法 [14-16] 。
本研究發現與其他試劑比較，試劑盒 1 對于元基因組 DNA 的提取效率最高。對提取液的組成、原理和方法進行了分析，發現快速提取液法通過煮沸去除核酸內切酶，但有資料顯示，有一些菌株含有的核酸內切酶靠煮沸是無法完全去除的，如含有 en－dA+基因型的菌株；此外，試劑盒 2 和試劑盒 3 所采用的方法在細胞破壁后，DNA 與核酸內切酶仍有充分接觸時間，DNA 有可能被降解；而離心柱分離通過吸附、快速漂洗和離心，減小了核酸內切酶與 DNA作用的面積和時間，并能有效的去除細胞代謝產物、蛋白等雜質，最后所得到的洗脫的基因組 DNA 純度較高。
使用提取模板擴增特異片段時發現即使是試劑盒 1，對金黃色葡萄球菌 DNA 的擴增效果也較差。這可能與革蘭氏陽性菌細胞壁結構影響提取效果有關。因此在改進方法中，加入了溶葡萄球菌酶和二倍體積的冰乙醇促進細菌壁的裂解，至此，改進的提取方法對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌均適用。
本研究建立了可用于免培養研究的室內空氣微生物采集及 DNA 提取方法，所得 DNA 樣品滿足普通 PCR 檢測需要，為空氣樣品微生物的免培養研究奠定了方法學基礎。
